Covid 19 hay Sar Cov 2 hiện đang trở thành mối đe dọa toàn cầu, gây ảnh hưởng nghiêm trọng đến sức khỏe, tính mạng của hàng trăm triệu người trên khắp thế giới, làm suy kiệt nền kinh tế của hầu khắp các nước. Bởi thế, việc nghiên cứu, phòng chống Sar Cov 2 đang trở thành ưu tiên hàng đầu của ngành y tế thế giới. Mới đây, vào cuối năm 2020, Cơ quan quản lý dược phẩm và thực phẩm Mỹ (FDA) đã cho phép dùng Cordycepin trong đông trùng hạ thảo nuôi cấy để chữa Sars – Cov -2. Dưới đây là bản dịch của nghiên cứu này.
Hiện nay, Covid 19 đang trở lại và nhiều người đã mắc bệnh. Trong đó, đã có 1 ca tử vong ở Hà Nội. Vì vậy hãy tự đảm bảo sức khỏe cho mình cũng như mọi người xung quanh. Bổ sung đầy đủ sức đề kháng bằng đông trùng hạ thảo ngay nhé!
Phần giới thiệu
Bệnh COVID-19 gây ra bởi RNA sợi đơn, có giác quan dương có chứa coronavirus mới, được đặt tên là coronavirus hội chứng hô hấp cấp tính nghiêm trọng 2 (SARS ‐ CoV ‐ 2) (trước đây tạm gọi là covid 19, coronavirus mới 2019; 2019 ‐ nCoV). Virus, hiện đang là đại dịch, đã lây nhiễm cho ít nhất 109 triệu người trên khắp thế giới, làm chết 2,4 triệu người (cho đến ngày 21 tháng 2 năm 2021). Các triệu chứng lâm sàng liên quan đến COVID ‐ 19 bao gồm sốt cao, ho nhẹ, đau người, không ngửi và nếm, tự giới hạn bệnh đường hô hấp thành viêm phổi tiến triển nặng dẫn đến suy đa phủ tạng dẫn đến tử vong . Đại dịch COVID-19 đặt ra một thách thức lớn trong tương lai gần đối với sức khỏe cộng đồng toàn cầu, kêu gọi sự phát triển của các phương pháp điều trị và dự phòng hiệu quả chống lại tác nhân gây bệnh. Do không có (các) loại thuốc kháng vi-rút mạnh để điều trị bệnh nhân COVID-19 dẫn đến việc yêu cầu thử nghiệm các loại thuốc kháng vi-rút hiện có (một mình hoặc kết hợp) đã được phê duyệt trước đây để sử dụng các vi-rút gần gũi về mặt di truyền của con người. Việc sử dụng lại thuốc hoặc tái định vị các loại thuốc đã ra mắt hoặc thậm chí đã thất bại trong quá trình chống lại các bệnh do virus mới xuất hiện. Việc làm đúng đắn nhất là kịp thời dùng phương pháp nghiên cứu ra thuốc mới bằng phương pháp dịch mã, phương pháp này mang lại xác suất thành công cao hơn đáng kể so với việc phát triển các loại thuốc và vắc xin đặc trị virus mới, xét về chi phí, thời gian và tính khả dụng trên lâm sàng
Bộ gen SARS ‐ CoV ‐ 2 bao gồm 6 khung đọc mở và mã cho một số protein cấu trúc và không cấu trúc. Protein cấu trúc bao gồm protein gai (S), protein màng (M), protein vỏ (E) và protein nucleocapsid (Ncp) liên kết chặt chẽ với bề mặt của virion trưởng thành. Protein Spike (S) được tạo thành từ hai tiểu đơn vị chức năng riêng biệt (S 1 và S 2 ) chịu trách nhiệm liên kết ( tiểu đơn vị S 1 ) và dung hợp ( tiểu đơn vị S 2 ) với màng tế bào chủ. S 1 xatiểu đơn vị chứa vùng liên kết thụ thể và ổn định trạng thái trước tưới máu của tiểu đơn vị S 2 cố định màng chứa bộ máy dung hợp. Đối với tất cả CoV, S tiếp tục được phân cắt và xử lý bởi protease vật chủ, TMPRSS2 tại vị trí S 2 ′ và trong một nghiên cứu gần đây, người ta đã báo cáo rằng chất ức chế protease serine, hoạt động trên TMPRSS2 ức chế đáng kể lây nhiễm coronavirus mới. Do đó, rõ ràng là sự xâm nhập của coronavirus vào các tế bào nhạy cảm là một quá trình phức tạp và nhiều bước đòi hỏi hoạt động phối hợp của quá trình liên kết thụ thể và phân giải protein của protein đột biến để thúc đẩy quá trình hợp nhất tế bào virus thành công.
Hơn nữa, sự trưởng thành của SARS ‐ CoV ‐ 2 cũng đòi hỏi một loạt các sự kiện phân giải protein rất phức tạp qua trung gian của protease chính (CoV M pro ; còn được gọi là 3Cl protease hoặc 3CL pro ) trên các polyprotein để kiểm soát sự biểu hiện gen của virus corona. M pro (~ 306 axit amin) là một protease cysteine với chymotrypsin giống như nếp gấp hai miền ở đầu cuối N bao gồm ba miền chức năng (I ‐ III). Phân tích cấu trúc của M pro cho thấy rằng hai phân tử M pro tạo thành một homodimer hoạt động. A Cys được định vị trong một khe nằm giữa miền I và II, và M proCác gốc đầu cuối N chủ yếu từ 1 đến 7 tham gia vào hoạt động phân giải protein, trong khi vùng đầu cuối C III được báo cáo là cần thiết cho quá trình đồng phân hóa. Hầu hết các sự kiện phân cắt trưởng thành trong polyprotein tiền thân là do protease chính CoV làm trung gian để ngăn chặn sự lây lan của bệnh tật bằng cách hạn chế sự phân cắt của polyprotein virus.
Cho đến nay, không có thuốc kháng vi rút đã được chứng minh lâm sàng để điều trị đại dịch COVID-19. Do tình hình nghiêm trọng và sự lây lan nhanh chóng trên toàn thế giới của SARS ‐ CoV ‐ 2, cần có những nỗ lực khẩn cấp và bổ sung để tìm ra các phương pháp phòng ngừa mới. Sự kết hợp giữa α-interferon và thuốc chống HIV Lopinavir / Ritonavir (Kaletra®) đã được thử nghiệm ở các mức độ nhiễm trùng khác nhau, nhưng hiệu quả điều trị bị hạn chế do tác dụng phụ nghiêm trọng trên vật chủ. Một loại thuốc kháng vi-rút phổ rộng, remdesivir, (của Gilead Sciences, Inc.) cũng đang trong cuộc đua thử nghiệm để điều trị COVID-19, nhưng thiếu dữ liệu thỏa đáng để chứng minh hiệu quả của nó. Cũng cần nhắc lại rằng, Hội đồng Nghiên cứu Y khoa Ấn Độ (ICMR), thuộc Bộ Y tế và Phúc lợi Gia đình (MHFW), đã khuyến nghị sử dụng hydroxychloroquine (400 mg hai lần vào ngày 1, sau đó 400 mg một lần một tuần sau đó) như dự phòng hóa học cho các nhân viên y tế không có triệu chứng trực tiếp tham gia điều trị COVID ‐ 19 bệnh nhân nghi ngờ hoặc xác nhận COVID ‐ 19, và cho những người tiếp xúc với hộ gia đình không có triệu chứng của các trường hợp được xác nhận ( F1,F2,F3).
Do đó, dữ liệu hiện có đã xác nhận rằng protein đột biến (S) và protease chính (M pro ) trong SARS ‐ CoV ‐ 2 đóng vai trò quan trọng trong quá trình xâm nhập của virus, sao chép bộ gen và tự nhân lên trong cơ thể vật chủ. Do đó, trong nghiên cứu này, các mục tiêu protein này đã được sử dụng trong quá trình mô phỏng tương tác phân tử với các loại thuốc điều tra và được FDA chấp thuận bằng cách sử dụng các công cụ tính toán khác nhau. Bài báo này nêu bật tiềm năng thay thế của các ứng cử viên thuốc kháng vi-rút đã biết chống lại SARS ‐ CoV ‐ 2.
Vật liệu và phương pháp
Lựa chọn và thu nhận các hợp chất hóa học
Thông tin về các tác nhân kháng vi-rút phổ rộng (BSAA, tức là các hợp chất nhắm vào các vi-rút thuộc hai hoặc nhiều họ vi-rút) được thu thập từ cơ sở dữ liệu có thể truy cập miễn phí ( drugvirus) của Andersen và cộng sự. Các phân tử thuốc được chọn thuộc danh mục điều tra hoặc được FDA chấp thuận chống lại SARS ‐ CoV ‐ 2, HCoV ‐ 229E, HCoV ‐ OC43, MERS ‐ CoV, và SARS ‐ CoV cũng như các bệnh ở người khác. Bốn mươi lăm ứng cử viên thuốc tiềm năng như trong Bảng 1 đã được xác định từ tài liệu PubMed ‐ NCBI có hoạt tính kháng vi rút mạnh chống lại các vi rút gần gũi về mặt di truyền của con người. Tình trạng hiện tại của tất cả các ứng cử viên thuốc chống lại protein mục tiêu SARS ‐ CoV ‐ 2 cũng được trình bày trong Bảng 2. Các cấu trúc 3D của tất cả các hợp chất đã được tải xuống ở định dạng tệp SDF / Mol được nhúng với các thuộc tính 3D từ cơ sở dữ liệu hợp chất PubChem, DrugBank và cơ sở dữ liệu ZINC. Sự sắp xếp phân tử và hình học của tất cả các hợp chất đã được tối ưu hóa hoàn toàn bằng cách sử dụng phương pháp hóa học lượng tử bán thực nghiệm (PM3). Cuối cùng, cấu trúc 3D được tối ưu hóa hoàn toàn của tất cả các phân tử thuốc đã được xuất ở định dạng Mol2 và được sử dụng để mô phỏng tương tác phân tử bằng các công cụ tính toán khác nhau.
Lựa chọn protein mục tiêu
Các protein mục tiêu liên kết với SARS ‐ CoV ‐ 2, cụ thể là vùng liên kết thụ thể protein đột biến (ID: 6VW1) và protease chính (6LU7), đã được sử dụng trong hiện tại học. Cấu trúc tinh thể của cả hai protein mục tiêu được lấy từ Ngân hàng Dữ liệu Protein RCSB. Các protein đích này đã được báo cáo về vai trò quan trọng của chúng trong quá trình lây nhiễm, sao chép, sống sót và nhân lên của SARS ‐ CoV ‐ 2 trong cơ thể vật chủ.
Mô phỏng tương tác phân tử
Tương tác giữa các phân tử giữa tất cả các ứng cử viên thuốc nghiên cứu và được FDA chấp thuận (Bảng 1 ) với các protein mục tiêu nói trên đã được nghiên cứu bằng cách sử dụng Molegro Virtual Docker (phần mềm MVD 2010.4.0 cho windows ‐ 7, thử nghiệm). Việc lựa chọn vị trí tích cực và chuẩn bị protein được thực hiện bằng chương trình có sẵn của phần mềm. Hơn nữa, phức hợp protein-phối tử được tạo ra sau khi thả cùng với các tương tác hóa học đã được Discovery Studio phân tích và hình dung thêm cùng phần mềm Chimera.
Mô hình học máy để định vị lại
Các mô hình học máy Bayes (từ màn hình thuốc được FDA chấp thuận) từ phần mềm Assay Central đã được sử dụng để xác định khả năng của các hợp chất có thể hoạt động chống lại SARS ‐ CoV ‐ 2. Tổng cộng 45 phân tử thuốc từ các màn hình được báo cáo trước đây về các hoạt động kháng vi-rút chống lại các vi-rút khác nhau ở người đã được sử dụng để xác nhận khả năng tái tạo tiềm năng của chúng bằng cách sử dụng mô hình học máy Bayes. Mỗi mô hình trong Assay Central sử dụng các số liệu khác nhau để đánh giá hiệu suất dự đoán như thu hồi, độ chính xác, độ đặc hiệu, F1 ‐ Score, đường cong đặc tính hoạt động của máy thu (ROC), Cohen’s Kappa (CK) và hệ số tương quan Matthews (MCC). Các mô hình này sử dụng dấu vân tay kết nối mở rộng của bộ mô tả đường kính tối đa 6 (ECFP6) được tạo từ thư viện.
Mạng lưới dược lý của (các) hợp chất mạnh
Tương tác giữa protein và các hợp chất hoặc thuốc có hoạt tính sinh học là một phần không thể thiếu của các quá trình sinh học trong cơ thể sống. Trong nghiên cứu này, mạng lưới tương tác dược lý của (các) ứng cử viên thuốc hoạt động mạnh nhất (trong bối cảnh với các tương tác phân tử) được xác định bằng thuật toán STITCH (Công cụ tìm kiếm hóa chất tương tác). Tương tác giữa thuốc và các thụ thể bao gồm các liên kết trực tiếp (vật lý) và gián tiếp (chức năng) và được tạo ra bởi dự đoán tính toán từ việc chuyển giao kiến thức giữa các sinh vật và từ các tương tác được tổng hợp từ các cơ sở dữ liệu khác (chính). Các tương tác trong STITCH được lấy từ các nguồn khác nhau như dự đoán ngữ cảnh bộ gen, (bảo tồn) đồng biểu hiện, khai thác văn bản tự động và kiến thức trước đó trong cơ sở dữ liệu (Szklarczyk và cộng sự, 2016).
Mô hình chuỗi
Đặc điểm dược lý của (các) ứng cử viên thuốc hoạt động nhất về ái lực cao hơn với protein đích được xác định bằng cách sử dụng phần mềm Ligandscout, phần mềm này cũng cho thấy mối quan hệ hoạt động cấu trúc (SAR) với (các) mục tiêu sinh học cụ thể. Các tệp cấu trúc 3D được tối ưu hóa hoàn toàn của (các) ứng viên thuốc (định dạng Mol2) đã được tải vào không gian làm việc của phần mềm Ligandscout và các tính năng dược lý chính đã được xác định. Các đặc điểm dược lý duy nhất được xem xét trong quá trình phân tích là chất nhận liên kết H, chất cho liên kết H, chất cho liên kết halogen, kỵ nước, thơm, và các nhóm có thể ion hóa dương và âm.
Thử nghiệm độc tính tế bào
Dịch vụ xét nghiệm in vitro kháng vi rút SARS ‐ CoV ‐ 2 đã được Viện Khoa học và Công nghệ Sức khỏe Dịch thuật (THSTI), NCR Biotech Science Cluster, Faridabad ‐ 01, Haryana, Ấn Độ cung cấp. Vì hoạt tính kháng vi-rút đã được thử nghiệm trong tế bào Vero E6, nên (các) chất thử nghiệm, tức là, cordycepin, không được gây độc tế bào đối với tế bào chủ ở nồng độ thử nghiệm / s; do đó, thử nghiệm độc tính tế bào đã được thực hiện trước khi thử nghiệm kháng ‐ SARS ‐ CoV ‐ 2. Thử nghiệm được thực hiện trong định dạng đĩa 96 giếng (Thermo Scientific Nunc. Edge 2.0) ở 3 giếng cho mỗi mẫu. Tế bào 1x10e4 VeroE6 được gieo hạt trên mỗi giếng và ủ ở 37 ° C qua đêm để hình thành đơn lớp. Ngày hôm sau, các tế bào được ủ với chất thử nghiệm (cordycepin) ở các nồng độ khác nhau (1, 5, 10, 20 và 50 μM). Tế bào không có chất thử nghiệm được sử dụng làm đối chứng âm tính, và Remdesivir đã được sử dụng như một loại thuốc đối chứng tích cực. Sau 24 và 48 giờ, các tế bào được nhuộm bằng thuốc nhuộm màu cam Hoechst 33342 và Sytox. Hình ảnh được chụp ở 10X, 16 hình ảnh trên mỗi giếng, bao phủ 90% diện tích giếng bằng ImageXpress Microconfocal (Molecular Devices, LLC, San Jose, CA ‐ 95134 USA). Nhuộm axit nucleic Hoechst 33342 là một vết bẩn phản ứng hạt nhân thấm qua tế bào phổ biến phát ra huỳnh quang màu xanh lam khi liên kết với dsDNA. Nó nhuộm tất cả các tế bào sống và chết. Thuốc nhuộm màu cam Sytox nhuộm axit nucleic trong các tế bào có màng bị tổn thương. Vết bẩn này là dấu hiệu cho thấy tế bào chết. Cuối cùng, phần trăm khả năng sống sót của tế bào được xác định ở nhóm điều trị bằng cordycepin so với nhóm chứng không được điều trị. bao phủ 90% diện tích giếng bằng ImageXpress Microconfocal (Molecular Devices, LLC, San Jose, CA ‐ 95134 USA). Nhuộm axit nucleic Hoechst 33342 là một vết bẩn phản ứng hạt nhân thấm qua tế bào phổ biến phát ra huỳnh quang màu xanh lam khi liên kết với dsDNA. Nó nhuộm tất cả các tế bào sống và chết. Thuốc nhuộm màu cam Sytox nhuộm axit nucleic trong các tế bào có màng bị tổn thương. Vết bẩn này là dấu hiệu cho thấy tế bào chết. Cuối cùng, phần trăm khả năng sống sót của tế bào được xác định ở nhóm điều trị bằng cordycepin so với nhóm chứng không được điều trị. bao phủ 90% diện tích giếng bằng ImageXpress Microconfocal (Molecular Devices, LLC, San Jose, CA ‐ 95134 USA). Nhuộm axit nucleic Hoechst 33342 là một vết bẩn phản ứng hạt nhân thấm qua tế bào phổ biến phát ra huỳnh quang màu xanh lam khi liên kết với dsDNA. Nó nhuộm tất cả các tế bào sống và chết. Thuốc nhuộm màu cam Sytox nhuộm axit nucleic trong các tế bào có màng bị tổn thương. Vết bẩn này là dấu hiệu cho thấy tế bào chết. Cuối cùng, phần trăm khả năng sống sót của tế bào được xác định ở nhóm điều trị bằng cordycepin so với nhóm chứng không được điều trị. Thuốc nhuộm màu cam Sytox nhuộm axit nucleic trong các tế bào có màng bị tổn thương. Vết bẩn này là dấu hiệu cho thấy tế bào chết. Cuối cùng, phần trăm khả năng sống sót của tế bào được xác định ở nhóm điều trị bằng cordycepin so với nhóm chứng không được điều trị. Thuốc nhuộm màu cam Sytox nhuộm axit nucleic trong các tế bào có màng bị tổn thương. Vết bẩn này là dấu hiệu cho thấy tế bào chết. Cuối cùng, phần trăm khả năng sống sót của tế bào được xác định ở nhóm điều trị bằng cordycepin so với nhóm chứng không được điều trị.
Kiểm tra tiêu diệt ‐ SARS ‐ CoV ‐ 2
Tóm lại, xét nghiệm được thực hiện ở định dạng đĩa 96 ‐ (Thermo Scientific Nunc Edge 2.0) ở 3 giếng cho mỗi mẫu. Tế bào 1 × 10e4 được mạ trên mỗi giếng và ủ ở 37 ° C qua đêm để hình thành đơn lớp. Tế bào được ủ với môi trường nuôi cấy có cordycepin ở nồng độ mạnh không gây độc tế bào (10 μM) được xác định như đã đề cập ở trên. Ngay sau đó (trong vòng 5 phút), vi rút được thêm vào mỗi giếng ở một số lượng nhiễm trùng xác định (MOI; 0,1 trong 2 giờ). Tế bào đối chứng được ủ với môi trường nuôi cấy có nồng độ xe tương ứng. Sau đó, đĩa này được ủ ở 37 ° C và dịch nuôi cấy ở trên được thu hoạch ở 24 và 48 giờ sau đó. RNA virus được chiết xuất bằng cách sử dụng Kit QIAcube HT QIAcube HT của virus QIAamp 96 (Qiagen, Hilden, Đức) từ 100 μl dịch nuôi cấy. Phiên mã ngược được thực hiện bằng cách sử dụng kit BioLine SensiFAST cDNA (Bioline, London, Anh), hỗn hợp phản ứng tổng (20 μl), chứa 10 μl chiết xuất RNA, 4 μl đệm 5 × TransAmp, 1 μl men sao chép ngược và 5 μl nước không chứa nuclease. Các phản ứng được ủ ở 25 ° C trong 10 phút, 42 ° C trong 15 phút và 85 ° C trong 5 phút. qRT ‐ PCR (Hệ thống sinh học ứng dụng, Thành phố Foster, CA, Hoa Kỳ) được thực hiện bằng cách sử dụng điều kiện chu kỳ 95 ° C trong 2 phút, 95 ° C trong 5 giây và 60 ° C trong 24 giây, và giá trị Ct cho gen N và E. trình tự đã được xác định. Dữ liệu thu được được sử dụng để tính% ức chế vi rút, nếu có. Ramdesivir được sử dụng như một biện pháp kiểm soát tích cực (Caly và cộng sự, và giá trị Ct cho trình tự gen N và E đã được xác định. Dữ liệu thu được được sử dụng để tính% ức chế vi rút, nếu có. Ramdesivir được sử dụng như một biện pháp kiểm soát tích cực (Caly và cộng sự, và giá trị Ct cho trình tự gen N và E đã được xác định. Dữ liệu thu được được sử dụng để tính% ức chế vi rút, nếu có. Ramdesivir được sử dụng như một biện pháp kiểm soát tích cực.
Phân tích thống kê
Dữ liệu về điểm kết nối phân tử của năm tư thế khác nhau được biểu thị bằng giá trị trung bình ± SD . Dữ liệu được phân tích bằng cách sử dụng ANOVA một chiều, theo sau là kiểm tra phạm vi của Tukey coi * p ≤ 0,05 là các giá trị có ý nghĩa tĩnh.
Nghiên cứu này nhằm xác định các phân tử / hoặc (các) ứng cử viên thuốc từ thư viện phân tử của các loại thuốc điều tra và được FDA chấp thuận có thể ức chế SARS ‐ CoV ‐ 2 bằng cách tác động lên các protein đích chính như protein đột biến (S) và các protease chính (M chuyên nghiệp ). Các kết quả thu được bằng mô phỏng tương tác phân tử cho thấy cordycepin tiếp theo là nitazoxanide, rapamycin, monensin, silvestrol, amiodarone, cepharanthine, indomethacin, promethazine và mefloquine cho thấy tương tác hóa học mạnh mẽ với vùng SARS ‐ CoV ‐ 2 RBD của protein đột biến. Tương tự, cordycepin liên kết mạnh với M pro, sau đó là monensin, promethazine, mefloquine, nitazoxanide, rapamycin, amiodarone, cepharanthine, silvestrol và indomethacin. Điều thú vị là chống lại cả các protein đích (S và M pro), cordycepin đóng vai trò như một phân tử xoay. Tiềm năng thay thế của cordycepin đã được xác nhận thêm bởi ECFP6 và thuật toán Bayes và thu được kết quả khả quan. Các tính năng dược lý đã chứng minh SAR của cordycepin do sự hiện diện của các chất mô tả duy nhất. Đồng thời, mạng lưới dược học cũng tiết lộ sự tham gia của cordycepin trong các con đường khác nhau liên quan đến các bệnh do vi khuẩn và vi rút như bệnh lao, viêm gan B, cúm A, viêm cơ tim do vi rút và nhiễm trùng herpes simplex. Hoạt tính kháng SARS ‐ CoV ‐ 2 của cordycepin cho thấy khả năng ức chế sao chép vi rút 65% (gen E)và 42% (gen N) sau 48 giờ điều trị. Các kết quả thu được khuyến khích thêm các cuộc điều tra in vitro và in vivo, đồng thời mở ra con đường mới để kiểm tra hiệu quả và độ an toàn của cordycepin chống lại COVID-19, một nhu cầu cấp thiết hiện nay.
Nguồn: https://onlinelibrary.wiley.com/doi/full/10.1111/cbdd.13812
